Técnica de Recuento por Dilución

Mediante el uso de esta técnica de simple ejecución y fácil interpretación, se pueden evaluar diferentes grupos bacterianos según el medio de cultivo que contenga el frasco.
Es aplicable para evaluar bacterias heterotróficas, aerobias totales (BAT), bacterias reductoras de sulfato (BRS), anaerobias heterotróficas totales (BAnT), etc.
Esta técnica está recomendada por el Instituto Americano del Petróleo (API) para evaluar calidad biológica en aguas de inyección en recuperación secundaria y también es ampliamente usada en evaluación de problemas microbiológicos en aguas de refrigeración.
Procedimiento.
La técnica de dilución por extinción consiste en inocular una serie de frascos tipo antibiótico que contienen 9 ml del medio de cultivo apropiado según el tipo de bacteria que se quiera evaluar.
Se obtiene 1 ml de la muestra usando una jeringa descartable, estéril, de 1 o 2 ml de capacidad.
Se inocula el primer frasco, sin retirar la aguja se agita el mismo, se invierte y se retira 1 ml que se inocula en el 2° frasco.
Con una nueva jeringa, se retira 1 ml del frasco N° 2, previamente agitado, y se inocula el frasco N° 3 y así sucesivamente, utilizando una nueva jeringa para cada frasco.

Si no existe información previa sobre cantidad de bacterias/mL de la muestra suelen sembrarse 6 frascos.
La manifestación de crecimiento bacteriano se observa por la turbidez del medio de cultivo que se compara por transparencia con un frasco sin inocular en el caso de bacterias aerobias totales y bacterias anaerobias totales; en el caso de bacterias reductoras de sulfatos se debe observar un ennegrecimiento del frasco.
Una vez inoculados los frascos y rotulados convenientemente, se incuban durante 7 días (BAT, BAT-RF, MFT, BPA) en estufa de cultivo a ±5ºC respecto de la temperatura del agua muestreada, efectuando lecturas diarias para observar aquellos frascos que manifiestan desarrollo positivo. Para el caso de los medios BRS y BRH, el plazo de lectura es de 28 días máximo, realizando también lecturas periódicas..
Cálculos de densidad bacteriana.
Se tienen en cuenta los frascos que manifiesten alguna modificación como consecuencia del crecimiento bacteriano; esta modificación puede ser turbidez, cambio de color, ennegrecimiento, etc.
Por ejemplo: si se usó el medio BAT-RF y se observa turbidez y/o cambio de color hasta el frasco N° 4 el resultado sería 1000-10000 bact/mL o exponencialmente 10³-10⁴ bact/mL.. Habitualmente se informa 10⁴ bact/mL.

Problemas comunes en la interpretación del crecimiento bacteriano cuando se utiliza la técnica de dilución por extinción.
Hay una variedad de acontecimientos que interfieren con la interpretación de resultados obtenidos utilizando las diluciones seriadas. Algunos de los mas comunes son:
· Todos los frascos muestran crecimiento.
Si esto sucede, no es posible estimar la población, por ejemplo si en una serie de 6 frascos inoculados todos se manifiestan positivos se debe informar:10⁶ bact/mL. Para el próximo análisis de esa muestra habría que considerar el empleo de 8 o 9 frascos.
· Un frasco no denota crecimiento y el resto sí.
Algunas veces uno de los frascos permanece sin cambios mientras que los ubicados anterior y posteriormente en la serie inoculada muestran positividad. Es decir, hay un “salto” en los frascos positivos. Este “salto” debe ser anotado y se informará la concentración bacteriana correspondiente al frasco de mayor numeración que resultó positivo. Por ejemplo: El crecimiento positivo se observa en los frascos 1, 2 y 4 mientras los frascos 3, 5 y 6 permanecen sin modificaciones, todo después de incubar a la temperatura y tiempo incubado. Hay varias explicaciones posibles para esto, incluyendo una contaminación accidental del frasco 4. Por lo tanto, nunca se puede saber que ocurrió realmente y hay que proceder de la forma más simple ante una situación dudosa.
En el ejemplo anterior, si se confía razonablemente en que los frascos fueron rotulados apropiadamente con su número de orden, el informe será 10⁴ bact/mL anotando el frasco que “saltó”.
· Frascos que se manifiestan positivo inmediatamente.
Si el primer frasco con un medio de cultivo para BRS se ennegrece dentro de las 2 horas de haber sido inoculado con 1 mL de agua muestra, este ennegrecimiento no es producto del crecimiento bacteriano dentro del frasco; el color negro es debido al SFe proveniente de altos niveles de SH2 en la muestra de agua que reaccionó con el Fe disuelto en el caldo de cultivo. En estos casos se pueden seguir dos cursos de acción:

1) Proceder con las diluciones seriadas. Los frascos 2 a 6 permanecerán generalmente sin cambios y pueden ser usados para detectar el crecimiento bacteriano incubándolos a temperatura y tiempo adecuado y observando ennegrecimiento en los mismos transcurrido el tiempo de incubación.

2) Colectar por lo menos 50 mL de agua en un frasco estéril y agregarle una tableta de Alka-Seltzer que puede despojar la mayoría del SH2 de la muestra. Cuando la tableta cesa de burbujear, retirar 1 mL de agua con jeringa estéril y llevar a cabo el procedimiento habitual de las diluciones seriadas.